Évaluation d'une nouvelle technique de biologie moléculaire, la LD-RTPCR, pour la recherche de réarrangement des gènes ALK, ROS et RET dans l'adénocarcinome pulmonaire

Résumé : Le diagnostic de réarrangement des gènes ALK, ROS et RET dans l'adénocarcinome pulmonaire repose actuellement sur un pré-criblage par immunohistoChimie (IHC) et sur la FISH, technique onéreuse et d'interprétation complexe. La LD-RTPCR utilise 2 sondes oligonucléotidiques hybridées de chaque côté de la jonction des 2 gènes impliqués dans le réarrangement. Ces sondes sont liguées puis amplifiées par PCR. Le produit de PCR est séquencé afin d'identifier les 2 gènes impliqués et leur point de cassure. Cette technique est multiplexée et peut être enrichie de sondes supplémentaires lorsque de nouveaux transcrits de fusion sont décrits. Elle coute 15€ par patient. Notre objectif est d'évaluer la faisabilité et la place de la LD-RTPCR pour la recherche de réarrangement des gènes ALK, ROS et RET dans l'adénocarcinome pulmonaire. Matériel/Méthode : Trente-huit cas et 1 lignée cellulaire réarrangés ALK, 14 cas réarrangés ROS et 1 cas réarrangé RET, testés dans notre routine diagnostique par IHC (marquage douteux à intense avec les clones D5F3, Ventana® et D406, Cell Signaling Technology®) et FISH (n5% de cellules réarrangées avec les sondes Vysis breakapart, Abbotte, ZytoLight® SPEC ROSI DualColor Breakapart Probe et ZytoLight SPEC RET Dual Color Break Apart Probe) ont été étudiés. L'ARN a été extrait avec le kit Maxwell@ 16 LEV RNA FFPE (Promega®) à partir de tissus formolés paraffinés. La RT-PCR a été réalisée avec le kit SuperScript® VILO® cDNA Synthesis (ThermoFischer Scientific®j et la ligation avec le kit Salsa® MLPA® (MRC-Hollancl(e). Le séquençage a été réalisé par pyroséquençage et séquençage de nouvelle génération (NGS). Résultats/Discussion : La sensibilité de la technique de LD-RTPCR, avant ajustement, est de 39.47% (n=38) pour ALK, 64,29% (n=14) pour ROS et 100% (n = 1) pour RET, avec une spécificité de 100% pour toutes les cohortes. L'accord avec notre technique de référence (test du Kappa de Cohen) est de 0,260 pour ALK et 0,643 pour ROS. Les 15 cas réarrangés ALK LD-RTPCR+ présentaient tous une IHC intense, avec une proportion de cellules tumorales réarrangées en FISH entre 20 et 88%. Le gène partenaire était exclusivement EML4, avec 5 points de cassure différents. Parmi les 23 cas ALK LD-RTPCR-, 8 présentaient une faible quantité d'ARN tumoral analysable (35%), 12 un immunomarquage d'intensité douteuse à modéré (52%) et 3 une proportion de cellules tumorales réarrangées en FISH entre 15% et 20% (13%). Lorsque l'on ne considère que les cas riches en ARN tumoral, avec une IHC intense, la sensibilité de la LD-RTPCR atteint 76,47% (Kappa = 0,746). Les 9 cas réarrangées ROS LD-RTPCR+ présentaient un immunomarquage douteux à intense et une proportion de cellules tumorales réarrangées en FISH entre 20 et 95%. Les gènes partenaires étaient CD74 et SLC34A2. Parmi les 5 cas ROS LD-RTPCR-, 3 avaient un immunomarquage douteux à faible (60%) et 1 présentait une proportion de cellules tumorales réarrangées en FISH entre 15% et 20% (20%). Le cas réarrangé RET était positif en LD-RTPCR : le gène partenaire identifié était KIF5B. Aucun transcrit de fusion n'a été identifié au niveau des 14 témoins négatifs. Conclusion : Ces résultats montrent que les transcrits de fusion ALK, ROS et RET dans l'adénocarcinome pulmonaire peuvent être mis en évidence par la LD-RTPCR, une technique non morphologique prometteuse qui pourrait à l'avenir permettre de limiter le nombre de FISH réalisées en routine diagnostique.
Type de document :
Mémoires
Médecine humaine et pathologie. 2016
Liste complète des métadonnées

Littérature citée [134 références]  Voir  Masquer  Télécharger

https://dumas.ccsd.cnrs.fr/dumas-01372480
Contributeur : Bibliothèque Universitaire Rouen <>
Soumis le : mardi 27 septembre 2016 - 11:57:13
Dernière modification le : jeudi 7 décembre 2017 - 12:34:13
Document(s) archivé(s) le : mercredi 28 décembre 2016 - 13:16:56

Identifiants

  • HAL Id : dumas-01372480, version 1

Citation

Claire Gravet. Évaluation d'une nouvelle technique de biologie moléculaire, la LD-RTPCR, pour la recherche de réarrangement des gènes ALK, ROS et RET dans l'adénocarcinome pulmonaire. Médecine humaine et pathologie. 2016. 〈dumas-01372480〉

Partager

Métriques

Consultations de la notice

39

Téléchargements de fichiers

25