Alternative à la thérapie génique additive par utilisation du système CRISPR-Cas9 pour la correction génique des maladies héréditaires du globule rouge - DUMAS - Dépôt Universitaire de Mémoires Après Soutenance Accéder directement au contenu
Mémoires Année : 2017

Alternative to additive gene therapy by CRISPR-Cas9 driven gene editing of red blood cells inherited diseases

Alternative à la thérapie génique additive par utilisation du système CRISPR-Cas9 pour la correction génique des maladies héréditaires du globule rouge

Résumé

Introduction: congenital erythropoietic porphyria (CEP) is a severe autosomal recessive disease. The most frequent mutation is c.217T>C on exon 4 of the UROS gene (p. C73R). To date, allogeneic cell transplantation of hematopoietic stem cells is the only effective treatment for CEP. Proof of disease cells correction by integrative lentiviral vectors in CEP mice was performed by additive gene therapy "ex vivo" but insertional mutagenesis risk persists. Our objective is to evaluate the feasibility of a directed, effective and definitive homologous recombination gene correction using the non-integrative and transient CRISPR-Cas9 technology in CEP. Method: First, we optimized the transfection by nucleofection in HEK cells and used tools to evaluate edition of the UROS gene: capillary electrophoresis (quantitative) and sequencing (qualitative). Results: We demonstrated the importance of single strand donor oligonucleotide concentration and created a CEP cell line that we rescued by homology directed repair. Then we demonstrated its effectiveness in primary cells by editing normal hematopoietic stem cells and correcting CEP deficient fibroblasts. Conclusion: finally, it remains to be confirmed that the system is transient and to extend our results in a more common hereditary hematologic disease such as sickle cell anemia.
Introduction : la Porphyrie érythropoïétique congénitale (PEC) est une maladie autosomique récessive sévère dont la mutation la plus fréquente est la c.217T>C sur l’exon 4 du gène UROS (p.C73R). Seule la thérapie cellulaire par greffe allogénique de cellules souches hématopoïétiques (CSH) constitue un traitement efficace pour la PEC à ce jour. La preuve d’une correction de cellules malades par des vecteurs lentiviraux intégratifs dans des souris PEC a été faite par thérapie génique additive « ex vivo » mais le principal risque reste la mutagénèse insertionnelle. Notre objectif est d’évaluer la faisabilité d’une correction génique dans la PEC, par réparation dirigée par homologie (HDR), efficace et définitive, grâce à la technologie CRISPR-Cas9 non intégrative et transitoire. Méthodes : d’abord, nous avons mis au point la technique de transfection par nucléofection dans des cellules HEK, et utilisé l’électrophorèse capillaire (quantitative) et du séquençage Sanger (qualitatif) comme outils pour évaluer l’édition du gène UROS. Résultats : nous avons démontré l’importance de la concentration en oligonucléotide donneur simple brin et créé une lignée PEC que vous avons ensuite corrigée par réparation dirigée par homologie. Puis, nous avons établi la preuve de principe de l’efficacité de ce système dans des cellules primaires par édition de cellules souches hématopoïétiques normales et la correction de fibroblastes déficients PEC. Conclusion : il nous reste à confirmer que le système est bien transitoire et que cette technique peut être utile pour une maladie hématologique héréditaire plus répandue comme la drépanocytose.
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Dates et versions

dumas-01567122 , version 1 (21-07-2017)

Identifiants

  • HAL Id : dumas-01567122 , version 1

Citer

Julian Boutin. Alternative à la thérapie génique additive par utilisation du système CRISPR-Cas9 pour la correction génique des maladies héréditaires du globule rouge. Médecine humaine et pathologie. 2017. ⟨dumas-01567122⟩
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