Mise en place d'un modèle cellulaire d'étude des granulomatoses septiques chroniques autosomales récessives - DUMAS - Dépôt Universitaire de Mémoires Après Soutenance Accéder directement au contenu
Mémoires Année : 2004

Mise en place d'un modèle cellulaire d'étude des granulomatoses septiques chroniques autosomales récessives

Résumé

La granulomatose septique chronique (CGD) est une maladie orpheline caractérisée par un défaut de fonctionnement de la NADPH oxydase des phagocytes professionnels. Cette enzyme est constituée d'un élément membranaire, le cytochrome b558, et de facteurs cytosoliques, p47phox, p67phox et p40phox. Le cytochrome b558 est formé de deux sous-unités, la glycoprotéine gp91phox et p22phox. Deux petites protéines G Rac1/2 et Rap1 sont également impliquées dans la régulation du fonctionnement de la NADPH oxydase. Au cours de son activation, l'assemblage des éléments cytosoliques et membranaires de l'enzyme permet la formation d'un complexe actif produisant des ions superoxyde. On distingue deux types de transmission de la CGD : la forme liée à l'X et les formes autosomales récessives (CGD AR) dûes à des mutations dans les gènes codant p22phox ou les deux facteurs cytosoliques (p47phox et p67phox). Ces dernières sont rares et les mutations géniques impliquées, très hétérogènes. Actuellement, il n'existe pas de modèles cellulaires qui permettent l'étude approfondie des CGD autosomales récessives et plus particulièrement les CGD AR+ dans lesquelles la protéine mutée est exprimée en quantité normale mais est non fonctionnelle. L'objectif de ce travail a été de mettre en place un modèle cellulaire permettant de reproduire les mutations géniques à l'origine des CGD AR ou d'en créer de novo, afin d'étudier l'impact de ces mutations sur le fonctionnement du complexe oxydase. Ce modèle a été réalisé dans les cellules fibroblastiques de rein de singe (cellules COS7). Dans un premier temps le contenu en ARNm et en protéines du complexe oxydase a été évalué dans ces cellules. La RT-PCR et le séquençage ont permis de mettre en évidence la présence des ARN messagers (ARNm) de p22phox, p67phox, p40phox et Rac1 dans les cellules COS7. Les résultats obtenus par western blot et cytométrie en flux ont montré que les protéines p22phox, p40phox et Rac étaient exprimées dans les cellules COS7. La seconde étape a été l'obtention de cellules COS7 exprimant le cytochrome b558. L'ADNc de gp91phox préalablement cloné dans un vecteur d'expression eucaryotique, a été transfecté de façon stable dans ces cellules. La fonctionnalité du cytochrome b558 recombinant exprimé dans les membranes plasmiques des cellules COS7 transfectées, a été évaluée en présence de cytosol de neutrophiles, afin de reconstituer une activité NADPH oxydase in vitro. A partir de ces cellules transgéniques, d'autres modèles exprimant le cytochrome b558 et un ou plusieurs facteurs cytosoliques ont été obtenus. Les ADNc de p47phox, p67phox et p40phox ont été clonés dans des vecteurs d'expression eucaryotique possédant des cassettes de résistance à un antibiotique différentes. Les modèles COS7-cytochrome b558 exprimant un ou plusieurs facteurs cytosoliques sont en cours d'évaluation et de caractérisation. Ces modèles cellulaires de CGD AR seront des outils intéressants pour étudier l'impact de certaines mutations des ADNc de p47phox ou p67phox sur le fonctionnement du complexe oxydase et les mécanismes moléculaires de son assemblage.
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Dates et versions

dumas-01578117 , version 1 (28-08-2017)

Identifiants

Citer

Delphine Tissot Dupont. Mise en place d'un modèle cellulaire d'étude des granulomatoses septiques chroniques autosomales récessives. Sciences pharmaceutiques. 2004. ⟨dumas-01578117⟩
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