Détermination de la fraction mutée de NPM1 par PCR digitale dans les leucémies aiguës myéloïdes - DUMAS - Dépôt Universitaire de Mémoires Après Soutenance Accéder directement au contenu
Mémoires Année : 2018

Determination of the mutated fraction of NPM1 by digital PCR in acute myeloid leukemias

Détermination de la fraction mutée de NPM1 par PCR digitale dans les leucémies aiguës myéloïdes

Arbab Ahmadreza
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1037482

Résumé

The mutation in the NPM1 (Nucleophosmin) gene represents one of the most frequently acquired mutations in acute myeloid leukemias (AML). In particular among AMLs with normal karyotype. Among the many types of NPM1 mutants, the type A mutation represents 80% of the mutants. The expression of mutants NPM1 constitutes a reliable molecular marker signifying the presence of residual leukemia cells. Residual disease monitoring is currently based on quantification of real-time quantitative PCR (RT-qPCR) mutated NPM1 transcripts. The results are expressed as "mutated / normal" ratio of mutants NPM1, and require the use of a reference gene. Digital PCR is a recent technology that allows the absolute quantification of a rare genetic event. It is based on the principle of micro-compartmentalisation of the sample, involving a method of dilution of the sample, followed by a conventional end-point PCR. Such an approach consists of the creation of thousands of microdroplets (ddPCR). The advantages of digital PCR are numerous: the reference gene is identical to the desired target, the sensitivity is almost identical to RQ-PCR and no use of plasmid range is required (essential in RQ-PCR). In this work, we have developed a digital droplet PCR (ddPCR), showing its feasibility on both genomic DNA and complementary DNA. At the same time, we were able to validate the applicability of the probe designed for the detection of NPM1 mutation variant A. ddPCR has proven to be a feasible and attractive method for longitudinal monitoring of mutated NPM1 AML patients.
La mutation du gène NPM1 (Nucleophosmine) représente d’une des mutations acquises les plus fréquemment observées dans les leucémies aiguës myéloïdes (LAM). En particulier parmi les LAM à caryotype normal. Parmi les nombreux types de mutants NPM, la mutation de type A, représente 80% des mutants. L’expression des mutants NPM1 constitue un marqueur moléculaire fiable signant la présence de cellules leucémiques résiduelles. Le monitoring de la maladie résiduelle s’appuie actuellement sur la quantification des transcrits NPM1 mutés par PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR). Les résultats sont exprimés en ratio « muté/normal » de mutants NPM1, et nécessite l’utilisation d’un gène de référence. La PCR digitale, est une technologie récente qui permet la quantification absolue d’un évènement génétique rare. Elle repose sur le principe de micro-compartimentation de l’échantillon, par une méthode de dilution de l’échantillon, suivie d’une PCR classique en point final. L’une de ces approches consiste en la création de milliers de microgouttelettes (ddPCR). Les points forts de la PCR digitale sont nombreux : gène de référence identique à la cible recherchée, sensibilité quasi identique à la RQ-PCR, absence d’utilisation de gamme plasmidique (indispensable en RQ-PCR). Dans ce travail, nous avons mis au point une PCR digitale en gouttelettes (ddPCR), en montrant sa faisabilité à la fois sur l’ADN génomique et l’ADN complémentaire. Parallèlement, nous avons pu valider l’applicabilité de la sonde conçue pour la détection du variant A de mutation NPM1. La ddPCR s’est avérée comme une méthode faisable et attractive dans le suivi longitudinal des patients LAM NPM1 muté.
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dumas-01896439 , version 1 (16-10-2018)

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Citer

Arbab Ahmadreza. Détermination de la fraction mutée de NPM1 par PCR digitale dans les leucémies aiguës myéloïdes. Médecine humaine et pathologie. 2018. ⟨dumas-01896439⟩
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