Mise en place de la détection de la mutation JAK2 V617 en PCR digitale - DUMAS - Dépôt Universitaire de Mémoires Après Soutenance Accéder directement au contenu
Mémoires Année : 2021

Implementation of digital PCR detection of the JAK2 V617F mutation

Mise en place de la détection de la mutation JAK2 V617 en PCR digitale

Manon Duprat
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1097807

Résumé

Vaquez's polycythemia, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis form the group of Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasias. These chronic haematological malignancies are associated with acquired genetic abnormalities that impart an advantage in proliferation and survival to haematopoietic stem cells. According to the new WHO 2016 classification, their diagnosis is based on several criterias, including the presence of the JAK2 gene V617F mutation. Currently, at the Saint Etienne University Hospital, the screening and quantification of the JAK2 V617F mutation are performed by quantitative PCR.The main aim of this study is to set up a new digital PCR technique for the detection of the JAK2 V617F mutation in order to apply for its accreditation. Indeed, since 2008, accreditation according to the NF EN ISO 15189 standard is mandatory. For this, laboratories must prepare method verification/validation files based on various documents proposed by COFRAC, such as SH GTA 04, which was used as a framework for this work. Digital PCR consists of distributing the sample in a large number of compartments either as micro-drops on a chip or as aqueous micro-drops suspended in a non-aqueous fluid. We have implemented the latter technology using Biorad® QXDx 200 droplet generator. Firstly, we optimised the operating protocol which allowed us to work in optimal conditions using 1.1µL of primer and 50ng of DNA per reaction well with an annealing temperature of 54°C. The results for repeatability, intermediate precision, accuracy and uncertainty of measurement complied with the laboratory requirements and literature data. The dPCR showed very good sensitivity and specificity values with 0.985 and 0.976 respectively. The tests to evaluate the limit of detection allowed us to obtain a value of 0.01% which is 10 times lower than the qPCR technique. Concomitantly with this work for the method validation file, we screened 30 patients with a history of thrombosis who had negative qPCR. None of these patients showed a positive signal in dPCR. Finally, we screened 26 patients for whom qPCR gave a very low allelic ratio (0.02% on average) below the detection limit. Of these, 17% were dPCR positive. We also performed a medico-economic study which showed that dPCR is 4 times less expensive than qPCR. For the detection of the JAK2 V617F mutation, we therefore replaced qPCR by dPCR, which not only is less expensive and less time-consuming but also has a better analytical performance.rformance.
La polyglobulie de Vaquez, la thrombocytémie essentielle et la myélofibrose primitive constituent le groupe des néoplasies myéloprolifératives Philadelphie négatives. Ce sont des hémopathies malignes chroniques associées à des anomalies génétiques acquises qui confèrent aux cellules souches hématopoïétiques un avantage de prolifération et de survie. Selon la nouvelle classification OMS 2016, leur diagnostic repose sur plusieurs critères dont la présence de la mutation V617F du gène JAK2. Actuellement au CHU de Saint Etienne, la recherche et la quantification de la mutation JAK2 V617F est effectuée en PCR quantitative. L’objectif principal de cette étude a été de mettre en place une nouvelle technique de PCR digitale pour la détection de la mutation JAK2 V617F pour ensuite faire la demande de son accréditation. En effet, depuis 2008, l’accréditation selon la norme NF EN ISO 15189 est obligatoire. Pour cela, les laboratoires doivent préparer des dossiers de vérification/validation de méthode en s’appuyant sur différents documents proposés par le COFRAC comme le SH GTA 04 qui a été utilisé comme trame pour ce travail. La PCR digitale consiste à répartir l’échantillon dans un grand nombre de compartiments soit sous forme de microchambes sur puce soit sous forme de micro-gouttelettes aqueuses en suspension dans un fluide non aqueux. C’est cette dernière technologie que nous avons mise en place grâce au générateur de gouttelettes QXDx 200 de Biorad®. Nous avons dans un premier temps réalisé une optimisation du protocole opératoire qui nous a permis de travailler dans les conditions optimales avec : 1.1µL d’amorce et 50 ng d’ADN par puits de réaction ainsi qu’à une température d’hybridation de 54°C. Les résultats de répétabilité, de fidélité intermédiaire, d’exactitude et d’incertitude de mesure sont revenus conformes aux exigences du laboratoire et aux données de la littérature. La dPCR a montré de très bonnes valeurs de sensibilité et spécificité avec respectivement 0.985 et 0.976. Les tests pour évaluer la limite de détection nous ont permis d’obtenir une valeur de 0.01% ce qui est 10 fois plus faible que la technique de qPCR. En parallèle de ces travaux pour la réalisation du dossier de validation de méthode, nous avons passé 30 patients avec antécédent de thrombose qui étaient sortis négatifs en qPCR. Aucun de ces patients n’a présenté de signal positif en dPCR. Pour finir, nous avons passé 26 patients pour lesquels la qPCR avait donné un ratio allélique très faible (0.02% en moyenne) en dessous du seuil de détection. Parmi ces derniers, 17% ont présentés un signal positif en dPCR. Nous avons également réalisé une étude médico-économique qui a montré que la dPCR est 4 fois moins onéreuse que la qPCR. Pour la détection de la mutation JAK2 V617F, nous avons donc remplacé la qPCR par la dPCR qui possède de meilleures performances analytiques en plus d’être une technique moins longue et moins couteuse.
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Dates et versions

dumas-03216930 , version 1 (04-05-2021)

Identifiants

Citer

Manon Duprat. Mise en place de la détection de la mutation JAK2 V617 en PCR digitale. Sciences pharmaceutiques. 2021. ⟨dumas-03216930⟩
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