Développement d'une méthode de dosage à base d'aptamères impliquant la formation d'un complexe boucle - boucle - DUMAS - Dépôt Universitaire de Mémoires Après Soutenance Accéder directement au contenu
Mémoires Année : 2015

Development of an aptamers based assay involving the formation of a loop - loop complex

Développement d'une méthode de dosage à base d'aptamères impliquant la formation d'un complexe boucle - boucle

Benoit Chovelon
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 998339

Résumé

Immunological assays are widely used analytical methods in a medical laboratory. An inventory has been conducted in the department of biochemistry, toxicology, pharmacology (DBTP, CHU Grenoble). Recently, a new class of recognition components, aptamers, was discovered by Ellington and the technology of systematic evolution of ligand by exponential enrichment (SELEX) was developed for the isolation of these oligonucleotides in 1990. These single-stranded DNA or RNA oligonucleotides that can bind their targets with high affinity and specificity have attracted tremendous attention and been supposed to be promising alternatives of conventional recognition elements. We reported here for a first time an Enzyme Linked Aptamer Kissing Complex Assay (ELAKCA). The Aptamer Kissing Complex strategy Assay is based on a dual recognition mechanism originating from the small target-induced formation of a supramolecular nucleic acid assembly. In the present work, a hairpin aptamer (named aptaswitch) was immobilized on a well via 5’-labeled primary amine. It can switch between folded and unfolded state in the presence and in the absence of target, respectively. The apical loop of the folded aptaswitch is then recognized by a second hairpin called aptakiss through loop-loop interaction forming a kissing complex that signals the presence of the target. Herein, the aptakiss was biotin labeled. Streptavidin–horseradish peroxidase (SA–HRP) was used to react with biotin in order to obtain quantitative signals. The system was applied to the assay of adenosine.
Les immunodosages sont omniprésents dans les laboratoires de biologie médicale. Un état des lieux des méthodes d’immunoanalyse utilisées au sein du Département de Biochimie, Toxicologie et Pharmacologie (DBTP) du CHU de Grenoble a été établi. Le dosage des molécules de petite taille n’utilise qu’un seul anticorps comme outil de reconnaissance moléculaire, ce qui pourra générer des défauts de sensibilité et de spécificité. La recherche de nouvelles méthodes de dosage dédiées aux petites molécules, spécifiques, robustes, peu coûteuses sont donc nécessaires pour s’affranchir des limites de l’immunoanalyse. Les aptamères sont des oligonucléotides sélectionnés par méthode SELEX pour se lier spécifiquement et avec une forte affinité à une cible. De par leur simplicité de synthèse et leur possibilité de reconnaître des cibles extrêmement variées, ils offrent une alternative très intéressante aux anticorps. Nous rapportons ici une nouvelle technique en phase hétérogène, basée sur l’induction par la cible d’un complexe kissing entre deux oligonucléotides (ELAKCA). Nous avons travaillé avec un aptamère modifié (aptaswitch) changeant de conformation au contact de sa cible. Une fois immobilisé dans les puits via une liaison amide, l’aptaswitch forme une épingle à cheveux en présence de la cible. Sa boucle apicale va être reconnue par la boucle d’un second oligonucléotide (aptakiss) organisé également en épingle à cheveux, pour former un complexe kissing. Le système a été appliqué au dosage de l’adénosine, la spécificité ainsi que les conditions de stockage et de réutilisation ont été étudiées. Enfin une courbe de calibration de l’adénosine a été réalisée en milieu complexe.
Fichier principal
Vignette du fichier
2015GRE17049_chovelon_benoit(1)(D)_version_diffusion.pdf (1.93 Mo) Télécharger le fichier
Loading...

Dates et versions

dumas-01435343 , version 1 (13-01-2017)

Identifiants

Citer

Benoit Chovelon. Développement d'une méthode de dosage à base d'aptamères impliquant la formation d'un complexe boucle - boucle. Sciences pharmaceutiques. 2015. ⟨dumas-01435343⟩
158 Consultations
2064 Téléchargements

Partager

Gmail Facebook X LinkedIn More