PolD, an atypical archaeal DNA polymerase and a promising tool for biotechnologies
La PolD, une ADN polymérase atypique d'arches et un nouvel outil prometteur pour les biotechnologies
Résumé
In all forms of life, DNA polymerases play a central role in genome replication, maintenance and repair. They are also valuable tools needed for many applications in molecular biology. All DNA polymerases were classified into seven distinct families based on their sequence homology: PolA, PolB, PolC, PolD, PolX, PolY and reverse transcriptases. The DNA polymerase family D, called PolD and whose structure has recently been resolved, remains the least well characterized. It has been discovered in thermophilic Archaea, and has interesting biochemical properties, exploitable by PCR (Polymerase Chain Reaction). It is an heterodimeric protein composed of a DP1 subunit responsible for the exonuclease activity, and a DP2 subunit responsible for the polymerization activity. The structures of DP1 and DP2 reveal that PolD is an atypical DNA polymerase. Indeed, the structure of the polymerase and exonuclease active sites differs from that of the other DNA polymerases characterized to date. PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) is a key player in the replication fork that dramatically improves the processivity of PolD both in vivo and in vitro. In this work, I was able to study the PolD and the PCNA of the Archaea Pyrococcus abyssi from several angles. At first, I worked on the PCNA alone to determine its structure by crystallography. Shortly after, I expressed and purified different PolD constructs in order to study the two proteins as part of their complexation using the bio-layer interferometry method. Crossing the data obtained allowed me to map their interactions and to propose a model of the ternary complex they form with DNA.
Dans toutes les formes de la vie, les ADN polymérases jouent un rôle central dans la réplication du génome, sa maintenance et sa réparation. Ce sont également des outils précieux nécessaires à de nombreuses applications en biologie moléculaire. Toutes les ADN polymérases ont été classées en sept familles distinctes en se basant sur leur homologie de séquence : PolA, PolB, PolC, PolD, PolX, PolY et les reverse transcriptases. L’ADN polymérase de la famille D, appelée PolD et dont la structure a récemment été résolue, demeure la moins bien caractérisée. Elle a été découverte chez des Archées thermophiles, et présente des propriétés biochimiques intéressantes, exploitables en PCR (réaction de polymérisation en chaîne). C’est une protéine hétérodimérique composée d’une sous-unité DP1 responsable de l’activité de relecture exonucléase, et d’une sous-unité DP2 responsable de l’activité de polymérisation. Les structures de DP1 et DP2 révèlent que la PolD est une ADN polymérase atypique. En effet, la structure des sites actifs polymérase et exonucléase diffère de celle des autre ADN polymérases caractérisées à ce jour. Le PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) est un acteur clé de la fourche de réplication qui améliore considérablement la processivité de la PolD à la fois in vivo et in vitro. Au cours de mes travaux, j’ai pu étudier la PolD et le PCNA de l’Archée Pyrococcus abyssi sous plusieurs angles. Dans un premier temps, j’ai travaillé sur le PCNA seul pour déterminer sa structure par cristallographie. Peu après, j’ai exprimé et purifié différentes constructions de la PolD afin d’étudier les deux protéines dans le cadre de leur complexation en utilisant la méthode d’interférométrie à bio-couches. Le croisement des données obtenues m’a permis d’établir une cartographie de leurs interactions et de proposer un modèle du complexe ternaire qu’elles forment avec l’ADN.
| Origine | Fichiers produits par l'(les) auteur(s) |
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