Mise au point et validation d’une méthode de dosage par HPLC-MS/MS de métabolites hydroxylés de la vitamine D - DUMAS - Dépôt Universitaire de Mémoires Après Soutenance Access content directly
Master Thesis Year : 2019

Development and validation of an HPLC-MS/MS assay method for vitamin D hydroxylated metabolites

Mise au point et validation d’une méthode de dosage par HPLC-MS/MS de métabolites hydroxylés de la vitamine D

Abstract

Hypersensitivity to vitamin D is defined by major hypercalcemia with hypercalciuria, sharp decreased level of parathormon (PTH) and increase of circulating 1,25-dihydroxyvitamin D. Diagnosed in adults and children, up to 20% of cases are due to a decline in the 24-hydroxylase activity of the CYP24A1 enzyme, involved in vitamin D catabolism. The diagnostic of this deficiency is based on long and expensive molecular analysis, sometime difficult to interpret. The use of the ratio between the serum concentrations of the metabolites 25OH-vitamin D3 and 24,25(OH)2-vitamin D3 has recently been suggested to identify patients who might present 24-hydroxylase deficiency. This ratio, named Vitamin D Hydroxymetabolite Ratio (VHR), tends to increase in patients with CYP24A1 mutations. This work has the objective of developing a fast and simultaneous assay for 24,25(OH)2-D3 et 25(OH)-D3 using high performance liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry. Method validation was conducted following the ISO 15189 guidelines. We set reference ranges for both compounds and VHR in a cohort of hypercalcaemic patients with decreased PTH. A threshold value of 31.1 for VHR allows to identify with maximal sensitivity and specificity patients with 24-hydroxylase deficiency from those without mutation on CYP24A1 gene. VHR could thus be a support for differential diagnosis of hypercalcemia when classical etiologies have been ruled out and allow a simple screening before molecular analysis of CYP24A1 gene
L’hypersensibilité à la vitamine D est caractérisée par une hypercalcémie majeure avec hypercalciurie, un taux de parathormone (PTH) effondré et une élévation de la 1,25-dihydroxyvitamine D circulante. Retrouvée chez l’adulte et l’enfant, elle est due dans 20% des cas à une diminution de l’activité 24-hydroxylase de l’enzyme CYP24A1, impliquée dans le catabolisme de la vitamine D. Le diagnostic de ce déficit repose sur des analyses de biologie moléculaire longues, coûteuses et d’interprétation parfois délicate. L’utilisation du ratio entre les concentrations sériques des métabolites 24,25(OH)2-vitamine D3 et 25(OH)-vitamine D3 a été récemment proposée afin d’identifier les patients susceptibles de présenter un déficit en 24-hydroxylase. Ce rapport, nommé Vitamin D Hydroxymetabolite Ratio (VHR), tend à augmenter chez des patients présentant des mutations sur le gène CYP24A1. Ce travail a pour objet la mise au point d’une méthode de dosage rapide et simultanée des composés 24,25(OH)2-D3 et 25(OH)-D3 par technique de chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem. La validation de la méthode a été réalisée selon les exigences de la norme ISO 15 189. Nous avons déterminé des intervalles de référence chez des patients hypercalcémiques avec PTH effondrée. La valeur seuil de 31,1 pour le VHR permet de distinguer avec une sensibilité et une spécificité maximales les patients présentant un déficit en 24-hydroxylase de ceux pour lesquels le gène CYP24A1 n’est pas muté. Le VHR constitue ainsi une aide au diagnostic différentiel des hypercalcémies et permet un screening simple préliminaire à une étude moléculaire du gène CYP24A1.
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Dates and versions

dumas-02451834 , version 1 (23-01-2020)

Identifiers

  • HAL Id : dumas-02451834 , version 1

Cite

Clémentine Gondolf. Mise au point et validation d’une méthode de dosage par HPLC-MS/MS de métabolites hydroxylés de la vitamine D. Sciences pharmaceutiques. 2019. ⟨dumas-02451834⟩
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