Mémoires Année : 2023

Roles of canine Natural Killer cells and development of their identification by flow cytometry at BioPôle Alfort

Rôles des cellules Natural Killer canines et mise au point de leur identification par cytométrie de flux au BioPôle Alfort

Résumé

Canine Natural Killer (NK) cells are key components of the innate immune response, a concept that is currently debated. They fall under the classification of innate lymphoid cells and contribute to various immunities within the body (antiviral, antibacterial, antiparasitic, antitumor). These properties make them of particular interest in the development of emerging therapies. However, these cells are also implicated in some pathologies of the body, ranging from graft rejection to various autoimmune diseases and even NK cell neoplasms. In the absence of available antibodies for tracking conventional markers in the canine species, the precise characterization of this specific cell population remains an important challenge to this day. Recent literature on this topic serves as evidence, and a consensus has not yet been clearly identified regarding the phenotype of canine NK cells. Given the importance of identifying NK cells, this thesis aims to attempt their identification using antibodies available at BioPôle Alfort (anti-CD3, anti-CD8, and anti-CD11b, with a hypothesis of CD3-/CD8+/CD11b+ phenotype for NK cells). These markers were applied to peripheral blood mononuclear cells from canine samples available at the immunology department of BioPôle Alfort. The results obtained indicate an average of approximately 0.1% for the CD3-/CD8+/CD11b+ phenotype and an average of 8.3% for CD3-/CD8+/CD11b- cells, with no influence of cell freezing or the animals' sex on the CD3-CD8+CD11b+ phenotype. As these values are significantly lower than the lowest estimate available in canine literature (2.5%, Gingrich et al., 2019), further trials involving other antibodies were attempted (anti-CD5 and anti-human NKp46), with no labeling observed during the experiments. Moreover, many samples came from dogs with neoplastic processes, including lymphoproliferative disorders, which could bias the results obtained. Now that the labeling has been technically established at the immunology department of BioPôle Alfort, further work on blood from healthy dogs is necessary to precisely identify the nature of CD3-CD8+CD11b+ and CD3-CD8+CD11b- cells (transcriptome analysis, cytotoxicity tests, visualization of the population in question, among other analyses). This will potentially offer clinicians the ability to phenotype canine NK cells when presented with lymphoma or leukemia cases, in addition to the traditionally proposed immunophenotyping methods.
Les cellules Natural Killer (NK) canines représentent des éléments clés de la réponse immunitaire innée au concept aujourd'hui débattu. Elles s'insèrent au sein de la classification des cellules lymphoïdes innées et contribuent à diverses immunités au sein de l'organisme ; leur valant un intérêt particulier dans le cadre de la mise en place de thérapies émergentes. Ces cellules sont en revanche impliquées dans certaines pathologies de l'organisme, allant du rejet de greffe à diverses maladies auto-immunes, voire des néoplasies des cellules NK. En l'absence d'anticorps disponibles pour suivre les marqueurs conventionnels dans l'espèce canine, la caractérisation précise de cette population cellulaire particulière reste à ce jour un enjeu important. La littérature récente à ce sujet en est la preuve et un consensus n'est pas encore clairement identifié sur le phénotype des cellules NK canines. Face à l'enjeu que représente l'identification des cellules NK, cette thèse a pour objet de tenter de les identifier à l'aide des anticorps disponibles au BioPôle Alfort (anti-CD3, anti-CD8 et anti-CD11b, avec une hypothèse de phénotype CD3-/CD8+/CD11b+ pour les cellules NK). Ces marquages ont été effectués sur des cellules mononucléées du sang périphérique, à partir d'échantillons canins disponibles au service d'immunologie du BioPôle Alfort. Les résultats obtenus indiquent près de 0,1 % en moyenne pour les cellules de phénotype CD3-/CD8+/CD11b+ et 8,3 % en moyenne pour les cellules CD3-/CD8+/CD11b-, sans influence de l'état de congélation des cellules, ni du sexe des animaux pour le phénotype CD3-CD8+CD11b+. Face à ces valeurs bien en deçà de l'estimation la plus basse disponible dans la littérature canine (2,5%, Gingrich et al., 2019), des essais incluant d'autres anticorps ont été tentés (anti-CD5 et anti-NKp46 humains), avec une absence de marquage lors des essais réalisés. De plus, de nombreux échantillons provenaient de chiens atteints de processus néoplasiques dont des troubles lymphoprolifératifs, pouvant biaiser les résultats obtenus. Le marquage étant maintenant mis au point techniquement au service d'immunologie du BioPôle Alfort, d'autres travaux sur du sang issu de chiens sains, sont nécessaires à l'identification précise de la nature des cellules CD3-CD8+CD11b+ et CD3-CD8+CD11b- (analyse du transcriptome, tests de cytotoxicité, visualisation de la population en question entre autres), afin de pouvoir offrir dans un futur proche, une possibilité de phénotyper les cellules NK canines au cliniciens, lors de présentation de lymphome ou de leucémie, en plus des immunophénotypages classiquement proposés.
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Citer

Ruben Clodion. Rôles des cellules Natural Killer canines et mise au point de leur identification par cytométrie de flux au BioPôle Alfort. Médecine vétérinaire et santé animale. 2023. ⟨dumas-04442003⟩
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