Étude du génome complet du virus de l'hépatite C par séquençage de nouvelle génération : mise au point et applications - DUMAS - Dépôt Universitaire de Mémoires Après Soutenance Accéder directement au contenu
Mémoires Année : 2015

Study of hepatitis C virux complete genome by next-generation sequencing : development and applications

Étude du génome complet du virus de l'hépatite C par séquençage de nouvelle génération : mise au point et applications

Résumé

Directly-acting antivirals brought considerable progress to hepatitis C treatment, but their activity varies depending on viral genotypes and subtypes. Therefore, accurate genotyping is still of major importance, as well as the detection of resistance-associated mutations. To answer these goals, an approach to amplify hepatitis C virus near-complete genome with a single long-range PCR and sequence it with a next-generation technique was developed. The overall amplification success rate was of 73% for usual genotypes (i.e. HCV1a, 1b, 3a and 4a, n = 16/22) and 45% for recombinant forms RF_2k/1b (n = 5/11). After pyrosequencing and de novo assembly, a near-full-length genomic consensus sequence was obtained for 19/21 samples. Genotype and subtype were confirmed by phylogenetic analysis for every sample, including the suspected recombinant forms. Circulation of this particular strain, difficult to identify, is probably underestimated. Ten cases have been detected in the Rhône-Alpes region between January and August 2014 in patients from the Caucasus area. All viral types considered, resistance-associated mutations were detected in 7/13 patients at baseline, in NS3 (n = 3) or NS5A region (n = 4). One of them was treated with daclatasvir and experienced a relapse. Viral sequences from pre- and post-treatment samples of four patients who had relapsed after a sofosbuvir-based therapy were compared: the selected variants seem too far from NS5B active site to be held responsible. Although tested on a limited set of samples and with technical improvements still needing to be made, this assay has proved to be successful both for genotyping and mutation detection on several HCV types.
Les antiviraux à action directe ont apporté des progrès considérables au traitement de l’hépatite C, mais leur activité varie selon les génotypes et sous-types viraux. Un typage fiable et précis est donc indispensable, de même que la détection des variants résistants. Une approche d’amplification du génome quasi-complet du virus de l’hépatite C par une PCR unique suivie d’un séquençage de nouvelle génération a été développée pour répondre à ces objectifs. Le taux de réussite de la RT-PCR était de 73 % pour les génotypes classiques (1a, 1b, 3a, et 4a, n = 16/22) et 45 % pour les formes recombinantes RF_2k/1b (n = 5/11). Après pyroséquençage puis assemblage de novo, les génomes quasi-complets ont pu être obtenus pour 19/21 échantillons. L’analyse phylogénétique a confirmé les génotypes et sous-types de tous les échantillons, incluant les recombinants. Cette souche, difficile à mettre en évidence, a été identifiée rétrospectivement chez dix patients en région Rhône-Alpes entre janvier et août 2014. Tous types viraux confondus, des mutations de résistance ont été détectées chez 7/13 patients naïfs de traitement, dans les régions NS3 (n = 3) ou NS5A (n = 4). L’un d’eux a ensuite rechuté après un traitement par daclatasvir. La comparaison chez quatre patients des séquences virales pré- et post-traitement par sofosbuvir a montré l’apparition de certains variants, mais trop éloignés du site actif de NS5B pour être responsables de la rechute. Bien que testée sur un nombre limité d’échantillons, et nécessitant encore des améliorations techniques, cette méthode a montré son efficacité pour le typage comme pour la détection des variants résistants sur différents types viraux du VHC.
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Dates et versions

dumas-01315019 , version 1 (12-05-2016)

Identifiants

Citer

Pauline Trémeaux. Étude du génome complet du virus de l'hépatite C par séquençage de nouvelle génération : mise au point et applications. Sciences pharmaceutiques. 2015. ⟨dumas-01315019⟩
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