Apport du séquençage nouvelle génération au typage MLST de Pneumocystis jirovecii dans le cadre d'une épidémie chez des patients transplantés d'organe solide - DUMAS - Dépôt Universitaire de Mémoires Après Soutenance Accéder directement au contenu
Mémoires Année : 2016

Added Value of Next Generation Sequencing for MLST Analysis of a Pneumocystis jirovecii Pneumonia Outbreak

Apport du séquençage nouvelle génération au typage MLST de Pneumocystis jirovecii dans le cadre d'une épidémie chez des patients transplantés d'organe solide

Résumé

Multilocus Sequence Typing (MLST) allows accurate strain characterization, but Sanger sequencing presents limitations for subpopulations determination. Yet, mixed strains coinfections are frequent in Pneumocystis jirovecii Pneumonia (PCP). Next Generation Sequencing (NGS) allows both majority and minority variant studies. We evaluated the added value of NGS in an epidemiological MLST study of a PCP cluster in solid organ transplant (SOT) recipients. Thirty-two patients (12 grouped cases SOT and 20 controls) presenting with PCP at Grenoble Hospital, France, were included between 2012 and 2015. A three loci scheme was used for MLST analysis (MIT26S, CYTB, SOD). New primers were designed to obtain ~ 750 bp amplicons (GS +). Sequencing was achieved on 32 samples with a NGS technology (GS junior +, Roche), and with Sanger technology for 12 of them. Among the 12 SOT, 5 shared a major genotype C2a. Proportion of mixed genotypes infections was significantly higher with NGS analysis (65%) compared to Sanger (25%). NGS approach revealed infections with more than 2 subpopulations (53%) and the presence of ultra-minority strains (1%) among which the C2a genotype. Transmission map confirmed the probable nosocomial PCP acquisition. The 732bp MIT26S sequence revealed three new SNPs and a new MNP which increased significantly the discriminatory power of MIT26S locus. As expected, in this context of PCP, NGS outperforms Sanger approach for sub-population determination and revealed new discriminating SNPs. These findings bring new insight for future epidemiological studies on this non cultivable opportunistic fungus.
Le typage par Multilocus Sequence Typing (MLST) offre une caractérisation précise des souches, mais les performances du séquençage Sanger (Sseq) dans la détection de variants minoritaires sont limitées. Or, les infections mixtes sont fréquentes dans les pneumonies à Pneumocystis jirovecii (PCP). Le séquençage nouvelle génération (NGS) permet l’étude des populations minoritaires et majoritaires. Nous avons étudié l’apport du NGS pour le typage MLST d’un cluster de PCP chez des patients transplantés d’organe solide (TOS). Trente-deux patients (12 TOS du cluster et 20 patients contrôle) présentant une PCP au CHU Grenoble-Alpes entre 2012 et 2015 ont été inclus. Une stratégie MLST à trois loci (MIT26S, CYTB, SOD) a été choisie, avec de nouvelles amorces afin d’obtenir des amplicons d'environ 750pb. Les souches de 12 des 32 patients ont aussi été analysées par Sseq. Parmi les 12 TOS, 5 partageaient un même génotype C2a, non retrouvé dans le groupe contrôle. La proportion d’infections mixtes était plus élevée avec le NGS (65%) qu’avec le Sseq (25%). Le NGS a révélé des infections avec plus de deux souches (53%), et la présence de souches ultra-minoritaires, parmi lesquelles le génotype C2a. Une carte de transmission a confirmé la probable acquisition nosocomiale de PCP. Les séquences étendues de MIT26S ont révélé 4 nouveaux polymorphismes augmentant significativement le pouvoir discriminant du locus. Comme attendu, dans ce contexte de PCP, le NGS surpasse les capacités du Sseq pour la détection d’infections mixtes et a mis en évidence de nouveaux polymorphismes. Ce travail ouvre de nouvelles perspectives pour les futures études épidémiologiques de ce champignon non cultivable.
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Citer

Eléna Charpentier. Apport du séquençage nouvelle génération au typage MLST de Pneumocystis jirovecii dans le cadre d'une épidémie chez des patients transplantés d'organe solide. Sciences pharmaceutiques. 2016. ⟨dumas-01564760⟩
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