Le typage par Multilocus Sequence Typing (MLST) offre une caractérisation précise des souches, mais les performances du séquençage Sanger (Sseq) dans la détection de variants minoritaires sont limitées. Or, les infections mixtes sont fréquentes dans les pneumonies à Pneumocystis jirovecii (PCP). Le séquençage nouvelle génération (NGS) permet l’étude des populations minoritaires et majoritaires. Nous avons étudié l’apport du NGS pour le typage MLST d’un cluster de PCP chez des patients transplantés d’organe solide (TOS). Trente-deux patients (12 TOS du cluster et 20 patients contrôle) présentant une PCP au CHU Grenoble-Alpes entre 2012 et 2015 ont été inclus. Une stratégie MLST à trois loci (MIT26S, CYTB, SOD) a été choisie, avec de nouvelles amorces afin d’obtenir des amplicons d'environ 750pb. Les souches de 12 des 32 patients ont aussi été analysées par Sseq. Parmi les 12 TOS, 5 partageaient un même génotype C2a, non retrouvé dans le groupe contrôle. La proportion d’infections mixtes était plus élevée avec le NGS (65%) qu’avec le Sseq (25%). Le NGS a révélé des infections avec plus de deux souches (53%), et la présence de souches ultra-minoritaires, parmi lesquelles le génotype C2a. Une carte de transmission a confirmé la probable acquisition nosocomiale de PCP. Les séquences étendues de MIT26S ont révélé 4 nouveaux polymorphismes augmentant significativement le pouvoir discriminant du locus. Comme attendu, dans ce contexte de PCP, le NGS surpasse les capacités du Sseq pour la détection d’infections mixtes et a mis en évidence de nouveaux polymorphismes. Ce travail ouvre de nouvelles perspectives pour les futures études épidémiologiques de ce champignon non cultivable.