Effect of withanolide-containing diet on gut microbial communities and AMP expression in two closely related Lepidoptera species : Heliothis subflexa and Heliothis virescens - DUMAS - Dépôt Universitaire de Mémoires Après Soutenance Access content directly
Master Thesis Year : 2018

Effect of withanolide-containing diet on gut microbial communities and AMP expression in two closely related Lepidoptera species : Heliothis subflexa and Heliothis virescens

Abstract

Every interaction between two organisms is a force driving the adaptation of one to the other and vice versa. This force of adaptation becomes more important as the number of interacting organisms and interaction levels increases. In this study we investigate the impact of withanolides, which are a group of plant secondary metabolites synthesized by Physalis plants, on the microbiota of two insect species in order to shed light on the mechanisms of insect-plant coevolution mediated by endosymbionts. We used the model system composed of the generalist lepidopteran moth Heliothis virescens and its close relative Heliothis subflexa, which is a specialist feeder of Physalis plants. We showed by means of bacterial 16S rRNA gene sequencing that H. subflexa has a more diversified gut microflora than H. virescens. Both gut bacterial communities were largely dominated by the genus Enterococcus. Withanolide supplementation to diet given to larvae had no significant effect on the diversity and richness of gut symbionts. In addition, we assessed the temporal expression levels of two antimicrobial peptides - i-type-lysozyme and attatcin-1 - under withanolide treatments on third instar larvae. We showed that the expression of attacin-1 was not affected by any of the treatments; however, i-type-lysozyme was upregulated after 24 hours.
Un des thèmes phares de la biologie de l’évolution est l’étude des interactions entre deux organismes et comment ces interactions deviennent des moteurs d’adaptation, ou plus précisément de coadaptation. Un exemple célèbre et largement étudié est celui des interactions entre les insectes et les plantes. Cette coévolution, souvent appelée « course aux armements », promeut plus souvent la spécialisation des insectes à un nombre réduit de quelques espèces de plantes phylogénétiquement proches qu’à l’expansion de la gamme d’hôte à un grand nombre de plantes (Ehrlich et Raven, 1964, Fox, 1981, Jaenike, 1990). Les plantes ont développé des mécanismes de défense pour se protéger contre les herbivores au moyen, entre autres, de composés appelés « métabolites secondaires de plantes » (MSP). Les insectes quant à eux ont évolué des moyens pour détoxifier leur nourriture, devenir tolérant voire même séquestrer les toxines végétales pour servir leurs propres intérêts (Heckel, 2014). Outre la gestion des toxines de plantes, les insectes doivent également résister aux attaques d’un grand nombre de pathogènes (Lacey et al., 2001). Cependant, comme pour la plupart des animaux, les insectes ne sont pas seuls pour y faire face. Ils sont accompagnés de microorganismes qu’ils portent dans leur intestins, et qui leur procure une grande variété de bienfaits (Frago et coll., 2012, Janson et coll., 2008, McFall-Ngai et coll., 2013). Les études montrant l'importance des microbes intestinaux sur ce sujet se sont multipliées au cours de la dernière décennie. Les symbiotes intestinaux sont connus pour dégrader les matières végétales indigestes, détoxifier l’organisme des MSP, et protéger l’hôte contre les agents pathogènes. Ils sont ainsi considérés comme une potentielle force évolutive capable de provoquer des changements de gamme hôtes chez les insectes. Dans certains cas, le microbiote intestinal de l'insecte serait même impliqué dans le développement de résistances aux insecticides (Pietri et Liang, 2018). Cette présente étude porte sur le système Heliothis subflexa et son espèce soeur Heliothis virescens. H. subflexa est un lépidoptère spécialiste des Physalis (Solanaceae) qui produisent des withanolides pour se défendre, alors que H. virescens peut se nourrir sur plus d’une dizaine de famille de plantes différentes excepté des Physalis (Brazzel, 1953; Cho et al., 2008). Les withanolides sont des lactones stéroïdiennes avec un ergonstane pour structure centrale (Misico et al., 2011). Ces molécules sont reconnues comme étant des antiappétants efficaces (Ascher et al., 1980), des antagonistes des ecdystéroïdes (Dinan et al., 1996), des immunosuppresseurs (Garcia et al., 2006) et pour présenter une activité antimicrobienne (Kurup, 1956). Ils sont répulsifs ou nocifs pour une grande quantité d'organismes. Une étude récente menée par Barthel et al. (2016) a montré dans des expériences d’alimentation que les withanolides bénéficiait à H. subflexa. Celui voyait en effet sa prise de poids relatif augmenter lorsque il en consommait. D’autre part, la consommation de withanolides avait un effet négatif sur H. virescens qui se traduisait par une perte de poids relatif en comparaison du contrôle. Les effets des withanolides portaient également sur l’immunité des deux insectes, l’activité phenoloxidase (PO) était augmentée chez H. subflexa alors qu’elle restait inchangée chez H. virescens. De plus l’apport de withanolides à leurs régimes alimentaires provoqua chez H. subflexa une augmentation non significative de l’expression de la plupart des gènes de l’immunité alors que ces mêmes gènes étaient réprimés chez H. virescens. Ces résultats ont inspiré la présente étude qui s’organise autour de deux questions : les microorganismes intestinaux d’H. subflexa interviennent-ils dans son adaptation aux Physalis ? Il y a-t-il un changement de composition de la microflore intestinale de ce dernier qui puisse expliquer la capacité de cet insecte à se nourrir de Physalis ? Et deuxièmement, cette étude s’intéresse à l’aspect temporel de la réponse immunitaire de cet insecte aux withanolides. Cette réponse est-elle rapide ou bien s’inscrit elle dans la durée ? Et quelle en est l’ampleur en terme que quantification de la surexpression des gènes de l’immunité ? Pour répondre à ces deux problématiques deux expériences de nutrition comprenant deux conditions de traitements ont été établies. Le premier traitement consistait en un extrait purifié de withanolide provenant de Physalis peruviana tandis que le second était du withaferin A, un withanolide disponible dans le commerce. Le traitement control était le méthanol, solvant dans lequel ces composés étaient dissouts. La première expérience consistait à appliquer les traitements de withanolides sur un régime alimentaire artificiel et de permettre à des larves de H. subflexa et H. virescens de s’en nourrir pour une durée de 48h. À l’issue de ce temps d’exposition les intestins des larves ont été disséqués et l’ADN génomique extrait. Les échantillons ont ensuite été envoyés à séquencer pour le gène bactérien ribosomal 16S. Les données brutes ont été traitées dans QIIME2 par le Dr. Shantanu Shukla qui a produit un tableau répertoriant le nombre de comptage obtenu par échantillon pour une séquence donnée. La seconde expérience consistait à exposer les larves à ces mêmes traitements sur des durées de une, six 12 et 24 heures, à l’issue desquelles l’ARN total a été extrait des larves entières, converti en ADN complémentaire et utilisé dans des réactions de PCR quantitatives en temps réel. Cela a permis de suivre au cours du temps l’expression relative de deux gènes de l’immunité : le peptide antimicrobien (AMP) attacine-1 et le lysozyme 1 de type i en réponse aux traitements. Les résultats de l’analyse métagénomique des intestins a montré que H. subflexa a une microflore intestinale plus diversifiée que celle de H. virescens, comprenant 70 familles bactériennes différentes contre seulement cinq chez H. virescens. Cependant le nombre total de séquences quantifiées dans les échantillons de H. subflexa variaient grandement. Certain échantillons comprenant seulement 388 ou 423 séquences lorsque tous les échantillons de H. virescens en avaient plus de 22687. Les deux communautés bactériennes intestinales étaient largement dominées par le genre bactérien Enterococcus. Ce dernier prévalait à 99,89% chez H. virescens et à 84,57% chez son espèce soeur. Ces observations ne sont pas inhabituelles pour des populations d’insectes de laboratoires. L’ajout de withanolides au régime alimentaire administré aux larves n'a pas eu d'effet significatif sur la diversité et la richesse intraspécifique de leurs symbiotes intestinaux. Seul la proportion relative a été impactée chez H. subflexa où l’ordre des Bacillales composait seulement 0,27% de la communauté totale sur le contrôle mais représentaient 4% et 31% lorsque les larves étaient exposées à l’extrait de withanolide et au withaferin A respectivement. Ces résultats suggèrent que H. subflexa n’a pas de communauté bactérienne résidente mais plutôt transitoire. Il a ensuite été montré que l'expression du gène de l'attacine-1 n'était pas affectée par les traitements alors le gène du lysozyme 1 de type i était surexprimé de manière significative après 24 heures chez les deux espèces comparé au temps zéro. Cependant, l’expression des deux gènes de l’immunité ne différait pas dans les conditions de traitement par rapport au contrôle, et ce pour tous les temps étudiés.
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dumas-02974813 , version 1 (09-11-2020)

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  • HAL Id : dumas-02974813 , version 1

Cite

Dries Amezian. Effect of withanolide-containing diet on gut microbial communities and AMP expression in two closely related Lepidoptera species : Heliothis subflexa and Heliothis virescens. Life Sciences [q-bio]. 2018. ⟨dumas-02974813⟩
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