Development of a standardized flow cytometric assay of peripheral blood neutrophil myeloperoxidase expression for ruling out myelodysplastic syndromes: comparative analysis of different permeabilization methods
Développement d'un test standardisé de quantification de l'expression de la myéloperoxydase des polynucléaires neutrophiles du sang périphérique par cytométrie en flux pour le diagnostic d'exclusion des syndromes myélodysplasiques : évaluation de différentes méthodes de perméabilisation
Résumé
Myelodysplastic syndromes (MDS) are clonal bone marrow neoplasms that predominate in the elderly whose diagnostic work-up relies on bone marrow aspiration. To prevent the risks and discomfort associated with bone marrow aspiration, a peripheral blood assay based on the semi-quantification of myeloperoxidase (MPO) in neutrophils by flow cytometry was jointly developed by three university-affiliated hospitals (Grenoble, Clermont-Ferrand and Saint-Etienne). An intra-individual robust coefficient of variation (RCV) value for peripheral blood neutrophil MPO expression lower than 30% accurately rules out MDS with a sensitivity estimate of 100%. The concept has been validated at Grenoble University Hospital and an inter-regional project has been accepted for multicenter validation. To facilitate the use of the test in other laboratories, it is important to ensure the possibility of using reagents other than those we have used, especially for membrane permeabilization. Indeed, many commercial kits are available in the commercial market.The aim of this study was to examine performances of two permeabilization kits (Dako Intrastain™ and BD FACS™ Permeabilizing Solution 2) compared to the method reference (BD Intrasure™ kit). We compared the RCV values for peripheral blood neutrophil MPO expression obtained with the 3 permeabilization methods for 10 controls and 10 cases. Controls were adults with unconfirmed suspicions of MDS. Cases were adults with established diagnosis of MDS or CMML, as defined by current guidelines. The RCV values with BD FACS™Permeabilizing Solution 2 were quantitatively comparable to the reference protocol (mean relative change, -1%). All cases with established MDS diagnosis had RCV values higher than 30%. However, RCV of neutrophil MPO expression using Dako InstraStain Kit appears to be different (mean relative change, +64%) and without discrimination between cases and controls. In conclusion, our findings suggest that BD FACS™ Permeabilizing Solution 2 represents a good technique for RCV of neutrophil MPO expression in peripheral blood compare with reference protocol. A standardization of different fixation/permeabilization methods is needed in order to use the published cut off 30%.
Les syndromes myélodysplasiques (SMD) sont des hémopathies clonales qui surviennent chez des sujets âgés dont le diagnostic repose sur le myélogramme. Pour limiter les risques et l’inconfort liés aux prélèvements de moelle, un test à partir de sang périphérique basé sur la semi-quantification de la myéloperoxydase (MPO) dans les polynucléaires neutrophiles (PN) par cytométrie en flux (CMF) a été développé conjointement par les CHU de Grenoble, Clermont-Ferrand et Saint-Etienne. Un coefficient de variation robuste (CVR) intra-individuel de la distribution de la MPO inférieur à 30% exclut le diagnostic avec une sensibilité proche de 100%. Le concept a été validé au CHU de Grenoble et un PHRC inter-régional a été accepté pour une validation multicentrique. Pour faciliter l’usage du test en routine dans d’autres laboratoires, il est important de s’assurer de la possibilité d’utiliser d’autres réactifs que ceux que nous avons employés, notamment pour la perméabilisation membranaire. De nombreux kits commerciaux sont en effet disponibles sur le marché. L’objectif de ce travail a été d’évaluer les performances de deux kits de perméabilisation, à savoir Intrastain™ (Dako, Denmark) et BD FACS™ Permeabilizing Solution 2 (BD Bioscience, San Jose, CA, USA), par rapport à la méthode de référence utilisant le kit Intrasure™ (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Nous avons comparé les CVR de l’expression de la MPO des PN sanguins obtenus avec les 3 méthodes de perméabilisation pour 10 patients suspects non SMD et 10 patients SMD. Les CVR obtenus avec la Permeabilizing Solution 2 étaient quantitativement comparables à la méthode de référence (changement relatif de -1% en moyenne). Vis-à-vis du seuil prédéfini à 30%, les interprétations étaient toutes concordantes entre les deux protocoles. Le protocole Intrastain générait des CVR très hétérogènes et plus élevés que la méthode de référence (changement relatif de +64% en moyenne) et sans discrimination entre SMD et non SMD. En conclusion, notre étude indique que le kit Permeabilizing Solution 2 pourrait être employé en tant que réactif de perméabilisation dans notre protocole. En revanche, l’hétérogénéité des CVR obtenus avec le kit Intrastain suggère qu’il ne convient pas dans le cadre de notre test. Cette étude est un travail préliminaire qui sera complétée par une étude de plus grande envergure avec d’autres kits commerciaux. A terme, elle permettrait de valider l’emploi de plusieurs kits de perméabilisation compatibles avec le test.
| Origine | Fichiers produits par l'(les) auteur(s) |
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