Aptamers in biological diagnosis: development of an assay with ICP-MS detection
Les aptamères au service du diagnostic biologique : développement d’un essai avec détection par ICP-MS
Résumé
Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS) is a powerful technique for trace elements analysis. Its use as a detection method in assays employing elemental tags allows for low detection limits and high sensitivity. Beyond traditionally found immunoassays, a number of assays using oligonucleotides or aptamers as recognition elements have been developed and are reviewed in the first part of this manuscript. Aptamers are single-stranded synthetic oligonucleotides that exhibit high affinity and specificity towards a given target. Often referred as "synthetic antibodies", they have several advantages over them, by their synthesis processes and their physicochemical properties, as well as ethical considerations. Commonly used elemental tags, such as metal-containing nanoparticles and lanthanide chelates, offer significant signal amplification and easy quantification with low background noise, respectively. However, they have certain limitations in terms of synthesis and handling conditions. The second part of this manuscript is dedicated to the development of a proof-of-concept using a non-metallic organic marker, L-thyroxine, that contains four iodine atoms detectable by ICP-MS. Our method, operating in a heterogeneous format, relies on a competitive assay for the detection of a small molecule (L-tyrosinamide) or a 'sandwich' technique for the detection of a protein (thrombin). The general design involves the use of an aptamer labeled at one end with a L-thyroxine molecule, as well as an immobilized capture agent on a microplate, which can be either a complementary DNA sequence or a second aptamer. Several experimental parameters such as the length of the complementary strand, sample recovery conditions, aptamer concentration, and incubation conditions of the aptamer-target complex have been explored. Under optimal conditions, detection limits in the nanomolar range (10^(-9) mol/L) were reported for both analytes. Furthermore, the potential applicability of this strategy in a biological environment was demonstrated, with effective detection of thrombin in a diluted urine matrix.
La spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) est une technique puissante pour l’analyse des éléments traces. Son utilisation comme méthode de révélation du signal dans des essais employant des marqueurs élémentaires permet d’obtenir de faibles limites de détection ainsi qu’une sensibilité élevée. Au-delà des immunodosages traditionnellement retrouvés, un certain nombre d’essais utilisant des oligonucléotides ou des aptamères comme agents de reconnaissance ont été développés, et on fait l’objet d’une revue de la littérature dans la première partie de ce manuscrit. Les aptamères sont des oligonucléotides synthétiques monocaténaires qui présentent une grande affinité ainsi qu’une spécificité élevée envers une cible précise. Souvent considérés comme des « anticorps synthétiques », ceux-ci présentent de nombreux atouts par rapport à ces derniers, aussi bien sur le processus de synthèse qu’au niveau de leurs propriétés physico-chimiques, ainsi que sur le plan éthique. Les marqueurs élémentaires couramment employés, à savoir les nanoparticules métalliques et les chélates de lanthanides, offrent respectivement une amplification significative du signal et un dosage aisé avec un faible bruit de fond. Ces derniers possèdent néanmoins certaines limites au niveau de leurs conditions de synthèse et de manipulation. La seconde partie de ce manuscrit est consacrée au développement d’une preuve de concept utilisant un marqueur organique non métallique, la L-thyroxine, comprenant 4 atomes d’iode détectables par ICP-MS. Notre méthode, opérant en phase hétérogène, est basée sur un dosage par compétition pour la détection d’une petite molécule (L-tyrosinamide), ou sur une technique dite « sandwich » pour la détection d’une protéine (thrombine). La conception générale implique l’utilisation d’un aptamère marqué à son extrémité par une molécule de L-thyroxine, ainsi que d’un agent de capture immobilisé sur une microplaque, étant soit une séquence d’ADN complémentaire, soit un second aptamère. Plusieurs paramètres expérimentaux tels que la longueur du brin complémentaire, les conditions de récupération de l’échantillon, la concentration en aptamère ainsi que les conditions d’incubation du complexe aptamère-cible, ont été explorés. En conditions optimales, des limites de détection de l’ordre du nanomolaire (10^(-9) mol/L) ont été rapportées pour les deux analytes. En outre, l’applicabilité potentielle de cette stratégie en milieu biologique a été démontrée, avec une détection effective de la thrombine dans une matrice urinaire diluée.
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