Évaluation d'une nouvelle technique de biologie moléculaire, la LD-RTPCR, pour la recherche de réarrangement des gènes ALK, ROS et RET dans l'adénocarcinome pulmonaire - DUMAS - Dépôt Universitaire de Mémoires Après Soutenance Accéder directement au contenu
Mémoires Année : 2016

Évaluation d'une nouvelle technique de biologie moléculaire, la LD-RTPCR, pour la recherche de réarrangement des gènes ALK, ROS et RET dans l'adénocarcinome pulmonaire

Résumé

Le diagnostic de réarrangement des gènes ALK, ROS et RET dans l'adénocarcinome pulmonaire repose actuellement sur un pré-criblage par immunohistoChimie (IHC) et sur la FISH, technique onéreuse et d'interprétation complexe. La LD-RTPCR utilise 2 sondes oligonucléotidiques hybridées de chaque côté de la jonction des 2 gènes impliqués dans le réarrangement. Ces sondes sont liguées puis amplifiées par PCR. Le produit de PCR est séquencé afin d'identifier les 2 gènes impliqués et leur point de cassure. Cette technique est multiplexée et peut être enrichie de sondes supplémentaires lorsque de nouveaux transcrits de fusion sont décrits. Elle coute 15€ par patient. Notre objectif est d'évaluer la faisabilité et la place de la LD-RTPCR pour la recherche de réarrangement des gènes ALK, ROS et RET dans l'adénocarcinome pulmonaire. Matériel/Méthode : Trente-huit cas et 1 lignée cellulaire réarrangés ALK, 14 cas réarrangés ROS et 1 cas réarrangé RET, testés dans notre routine diagnostique par IHC (marquage douteux à intense avec les clones D5F3, Ventana® et D406, Cell Signaling Technology®) et FISH (n5% de cellules réarrangées avec les sondes Vysis breakapart, Abbotte, ZytoLight® SPEC ROSI DualColor Breakapart Probe et ZytoLight SPEC RET Dual Color Break Apart Probe) ont été étudiés. L'ARN a été extrait avec le kit Maxwell@ 16 LEV RNA FFPE (Promega®) à partir de tissus formolés paraffinés. La RT-PCR a été réalisée avec le kit SuperScript® VILO® cDNA Synthesis (ThermoFischer Scientific®j et la ligation avec le kit Salsa® MLPA® (MRC-Hollancl(e). Le séquençage a été réalisé par pyroséquençage et séquençage de nouvelle génération (NGS). Résultats/Discussion : La sensibilité de la technique de LD-RTPCR, avant ajustement, est de 39.47% (n=38) pour ALK, 64,29% (n=14) pour ROS et 100% (n = 1) pour RET, avec une spécificité de 100% pour toutes les cohortes. L'accord avec notre technique de référence (test du Kappa de Cohen) est de 0,260 pour ALK et 0,643 pour ROS. Les 15 cas réarrangés ALK LD-RTPCR+ présentaient tous une IHC intense, avec une proportion de cellules tumorales réarrangées en FISH entre 20 et 88%. Le gène partenaire était exclusivement EML4, avec 5 points de cassure différents. Parmi les 23 cas ALK LD-RTPCR-, 8 présentaient une faible quantité d'ARN tumoral analysable (35%), 12 un immunomarquage d'intensité douteuse à modéré (52%) et 3 une proportion de cellules tumorales réarrangées en FISH entre 15% et 20% (13%). Lorsque l'on ne considère que les cas riches en ARN tumoral, avec une IHC intense, la sensibilité de la LD-RTPCR atteint 76,47% (Kappa = 0,746). Les 9 cas réarrangées ROS LD-RTPCR+ présentaient un immunomarquage douteux à intense et une proportion de cellules tumorales réarrangées en FISH entre 20 et 95%. Les gènes partenaires étaient CD74 et SLC34A2. Parmi les 5 cas ROS LD-RTPCR-, 3 avaient un immunomarquage douteux à faible (60%) et 1 présentait une proportion de cellules tumorales réarrangées en FISH entre 15% et 20% (20%). Le cas réarrangé RET était positif en LD-RTPCR : le gène partenaire identifié était KIF5B. Aucun transcrit de fusion n'a été identifié au niveau des 14 témoins négatifs. Conclusion : Ces résultats montrent que les transcrits de fusion ALK, ROS et RET dans l'adénocarcinome pulmonaire peuvent être mis en évidence par la LD-RTPCR, une technique non morphologique prometteuse qui pourrait à l'avenir permettre de limiter le nombre de FISH réalisées en routine diagnostique.
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Dates et versions

dumas-01372480 , version 1 (27-09-2016)

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  • HAL Id : dumas-01372480 , version 1

Citer

Claire Gravet. Évaluation d'une nouvelle technique de biologie moléculaire, la LD-RTPCR, pour la recherche de réarrangement des gènes ALK, ROS et RET dans l'adénocarcinome pulmonaire. Médecine humaine et pathologie. 2016. ⟨dumas-01372480⟩
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